摘要：目的：建立乌头中毒致死的动物检材中乌头类生物碱的LC/MS/MS分析方法。方法：将生物检材用氨水调pH值为8~9，用氯仿/乙醚（1：4）萃取生物检材样品，采用电喷雾离子源，正离子模式检测。结果：在中毒致死的动物检材中发现了乌头碱、中乌头碱和次乌头碱。结论：LC/MS/MS法灵敏可靠，样品处理快速简便，适用于生物检材中乌头类生物碱的检测。
　　
　　关键词：法医毒物分析；乌头；生物检材；乌头类生物碱；LC/MS/MS
　　
　　乌头（RadixAconiti）为川乌或草乌的子根，附子为其附根[1]。由于毒性巨大，中医应用的均为炮制品[2]。乌头与附子的化学成分基本相同，主要的有效成分和毒性成分是双酯型生物碱，其中乌头碱、中乌头碱和次乌头碱含量最高，可以作为鉴定的指标[3]。乌头与附子具有祛风除湿、温经止痛之功效，外用可治疗跌打劳伤，酒泡制后内服抗风湿，或煎煮后服用滋补身体[4]。但是，由于使用不当而造成中毒甚者致死的情况常常发生[5]。
　　
　　对于中毒死亡的案件，对死者的生物检材进行毒物毒性分析，可以帮助澄清死亡案件的性质，通过法医毒化分析，区分是中毒死亡还是因病猝死。
　　
　　对于乌头类中药中毒的法医鉴定，现多采用HPLC法[6]。因毒性物质乌头碱不稳定，代谢迅速，同时HPLC法的灵敏度不够，在多数案例检测不到。为了模拟案情，本试验检测了死亡7天后大鼠尸体的凝血和肝脏样品内的主要双酯型生物碱的含量，为法医鉴定提供了依据。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1仪器试药与动物
　　
　　API5000质谱仪（AB，美国）；HP1100系列液相色谱仪（Agilent，美国）。离心机(Ependorf，美国)；样品浓缩仪（青岛路博伟业，中国）乌头碱、中乌头碱、次乌头碱和高乌甲素标准样品（购于中国药品生物制品检定所）；制川乌、制附子（购于通辽百草堂）；甲醇、乙腈均为色谱纯（Fisher，美国）；乙醇、氯仿、乙醚和氨水等均为分析纯(北京化学试剂公司)；蒸馏水(自制)。
　　
　　健康雄性SD大鼠，体重180~220g。购自内蒙古民族大学动物试验中心。
　　
　　1.2仪器条件
　　
　　色谱条件：thermoC18extend（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱，流动相为0.2%醋酸氨水溶液:乙腈（20:80），柱温38℃，流速0.5mL•min-1。
　　
　　质谱条件：电喷雾离子源，正离子MRM扫描，气帘气流速20L•min-1，碰撞气流速6L•min-1，雾化气流速10L•min-1，离子源电压5.5kV，离子源温度400℃。
　　
　　1.3溶液的制备
　　
　　1.3.1储备液的制备精确称取乌头碱、中乌头碱和次乌头碱适量，用甲醇配成浓度分别为1.7、1.2和1.1mg•mL-1的混合溶液。精密称取高乌甲素适量，用甲醇配成浓度为1.3mg•mL-1的溶液。储备溶液置于4℃冰箱内保存。
　　
　　1.3.2药液的制备取制川乌和制附子各50g，置200mL水中，混合煎煮15min，放凉后过滤，待用。
　　
　　1.4动物处置
　　
　　雄性大鼠5只，试验前禁食12h，自由饮水。分次给予药材提取液，累计给药液量相当于每公斤体重10g生药材。中毒死亡后的大鼠置4℃低温存放，于7天后采集心脏凝血样和肝脏样品。
　　
　　1.5生物检材的处理
　　
　　取凝血1g，加入5mL蒸馏水，用高速破碎器粉碎，用稀盐酸调pH值为2，3500r•min-1离心5min，取上清液用稀氨水调pH值为9，加5mL氯仿/乙醚（1：4）混合液萃取两次，合并萃取液后于样品浓缩仪中挥干溶剂，残渣用500μL乙腈溶解，取10μL进LC/MS/MS分析。肝脏样品取1g，与凝血样品操作相同。
　　
　　1.6方法学考察
　　
　　1.6.1专属性试验取空白血样1g，肝脏样品1g，分别加入混合标准品溶液40μL（含乌头碱浓度为136ng•mL-1、次乌头碱浓度为96ng•mL-1和新乌头碱浓度为96ng•mL-1），再加入浓度为65ng•mL-1的高乌甲素溶液40μL，按照2.5方法操作制得加药血样和加药肝脏样品；取空白血样1g，肝脏样品1g，分别加入甲醇80μL，按照2.5方法操作制得空白血样和空白肝脏样品；将所得样品注入到液质联用仪进行分析，考察血样和肝脏样品的内源性物质是否有干扰。
　　
　　1.6.2线性关系考察向空白胃内容物、空白血样和空白肝脏样品中添加乌头碱、次乌头碱、新乌头碱和高乌甲素标准样品储备液,使生物样品中含乌头碱（8.5、17.0、34.0、68.0、136.0、272.0、544.0ng•mL-1）、含次乌头碱（6.0、12.0、24.0、48.0、96.0、192.0、384.0ng•mL-1）、新乌头碱（6.0、12.0、24.0、48.0、96.0、192.0、384.0ng•mL-1）和高乌甲素65ng•mL-1。
　　
　　按2.5所述方法进行处理并分析。乌头碱、次乌头碱和新乌头碱浓度为X，样品与内标物的峰面积之比为Y，进行线性回归方程计算，考查线性范围。
　　
　　1.6.3回收率与批内精密度取空白血样18份，分成3组，向其中加入各种标准溶液，使第1组样品含乌头碱8.5ng•mL-1、次乌头碱6.0ng•mL-1、新乌头碱6.0ng•mL-1、高乌甲素65.0ng•mL-1；第2组样品含有乌头碱68ng•mL-1、次乌头碱48ng•mL-1、新乌头碱48ng•mL-1、高乌甲素65.0ng•mL-1；第3组样品含有乌头碱544ng•mL-1、次乌头碱384ng•mL-1、新乌头碱384ng•mL-1、高乌甲素65.0ng•mL-1。将样品按2.5.1方法处理。将肝脏样品按上述试验设计，分别制备3个浓度共18份样品，每个浓度6平行操作。按2.5方法处理。处理后进液质联用仪进行分析，按照标准曲线计算浓度，求算回收率和批内精密度。