摘要:为探讨孤儿核受体(Nurr1)在多巴胺能神经元损伤修复过程中对特异性表型酪氨酸羟化酶(TH)的影响,本研究用62羟基多巴胺(62OHDA)损伤大鼠一侧前脑内侧束(MFB)制备单侧帕金森病(PD)模型,分别应用Westernblot和免疫组织化学技术观察不同时间点中脑黑质中Nurr1、TH蛋白表达的变化及其相关性。结果显示,Nurr1蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中即明显下降,7d后开始逐渐上升,14d接近正常水平,28d明显升高;TH蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中无明显变化,7d开始下降,14d达最低,28d开始上升。上述结果提示,在62OHDA损伤黑质2纹状体通路后,Nurr1的表达先下降后上升,其表达变化早于TH,可能在PD模型大鼠的损伤修复中发挥重要作用。
　　
　　 关键词:帕金森病黑质孤儿核受体酪氨酸羟化酶大鼠
　　
　　 孤儿核受体(nuclearreceptor2relatedfactor1,Nurr1)是类固醇/甲状腺激素核受体转录因子超家族中的成员,配体未知。近年来的研究发现,Nurr1主要分布于中枢神经系统,它不仅在胚胎发育过程中与中脑多巴胺神经元的发育分化及存活密切相关[1,2],而且在帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)模型大鼠的诸多脑区也有表达[3],提示Nurr1在成年大鼠中枢神经系统损伤修复的过程中也发挥一定的作用。本研究应用Westernblot和免疫组织化学技术观察了62羟基多巴胺(62Hydroxydopamine,62OH2DA)损伤单侧前脑内侧束(medialforebrainbundle,MFB)后不同时间点中脑黑质中Nurr1与酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase,TH)的表达变化关系,为进一步探讨Nurr1在PD模型大鼠多巴胺神经元损伤及再生修复中的作用奠定基础。
　　
　　 材料和方法
　　
　　 1.单侧PD模型制备
　　
　　 取健康成年SD大鼠48只(本校实验动物中心提供),体重220～250g,雌雄不拘,随机分成术后1、7、14、28d4组,每组12只,Westernblot和免疫组化各6只。用复合麻醉剂Chlorpent(0.2ml/100g)腹腔注射麻醉,麻醉后固定于脑立体定位仪上,暴露前囟,参照Paxinos图谱确定右侧MFB的注射坐标:前囟后4.8mm,中线右旁开1.0mm,硬膜下8.1mm。颅骨上钻孔,用10μl微量进样器抽取0.2%62OHDA(Sigma)4μl,进针到达预定深度后用电子微泵缓慢匀速注射,留针10min。术后1d开始腹腔注射阿朴吗啡(Sigma,0.5mg/kg),5min后纪录30min内的旋转圈数,大于210圈者视为成功模型。
　　
　　 2.Westernblot
　　
　　 各组取6只大鼠麻醉后分别取双侧腹侧中脑制成匀浆,Lorry改良法进行蛋白总量测定,浓度稀释为3μg/μl后分装,-70℃保存备用。各组取样品45μg行10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS2PAGE)垂直电泳分离蛋白。Bio2Rad半干转印系统转膜,5%脱酯奶粉封闭1.5h,再用兔抗Nurr1抗体(1∶200,Santacruz公司)、兔抗TH抗体(1∶1000,Chemicon公司)、鼠抗β2actin抗体(1∶2000,Sigma公司)室温孵育2h,4℃过夜。TBST洗涤后分别加入辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗兔IgG(1∶1000,Pierce公司)和抗鼠IgG(1∶1000,Pierce公司)室温孵育4h,TBST洗涤后加入ECL(Pierce公司)化学发光剂,胶片暴光1min后显影、定影、晾干。
　　
　　 3.固定和切片
　　
　　 各组另6只模型鼠进行灌注固定:先经心脏灌注100ml生理盐水,然后灌注4%多聚甲醛400ml,取脑置于4%多聚甲醛中后固定6h,再分别入20%和30%蔗糖溶液中4℃过夜至沉底。取黑质部位行冠状位冰冻连续切片,片厚15μm,贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。
　　
　　 4.Nurr1、TH免疫组化染色
　　
　　 每组随机取18张切片用0.01mol/LPBS(pH7.2)充分漂洗后,每张切片滴加10%山羊血清50μl封闭过夜,吸去山羊血清,其中一半切片滴加1∶100稀释的兔抗Nurr1多克隆抗体(Santacruz)50μl,另一半切片滴加1:2000稀释的兔抗TH多克隆抗体(Chemicon)50μl,4℃湿盒孵育72h。用PBS漂洗3遍,每张切片再滴加1∶200稀释的结合有生物素的山羊抗兔二抗(Vector)50μl,4℃湿盒孵育48h。再用PBS漂洗3遍后,每张切片滴加ABC液(Vector)50μl,4℃湿盒孵育24h。最终经PBS洗片后,用DAB呈色。常规脱水、透明、封片,镜下观察。另选取3套切片作为阴性对照,用山羊血清替代一抗,其余步骤相同,结果为阴性。
　　
　　 5.图像处理和统计学分析
　　
　　 用捷达801形态学分析系统对Westernblot结果中Nurr1、TH和内参β2actin阳性条带分别进行平均灰度值检测,Nurr1、TH与内参的比值分别表示Nurr1和TH的相对表达量。免疫组化切片在放大400倍的Leica正置显微镜下观察,将摄取的照片导入LeicaQwin图像分析系统,对每张切片Nurr1和TH阳性细胞进行计数,并测定其灰度值。用Spss11.5统计软件对各组数据进行方差分析和组间比较。
　　
　　 结果
　　
　　 1.PD模型检测
　　
　　 术后1d至7d,腹腔注射阿朴吗啡后,多数大鼠无旋转,少数大鼠有轻微的旋转,但30min内旋转圈数少于210圈。从7d后开始,大多数大鼠表现为典型的旋转行为:一种无法控制的向健侧(左侧)作逆时针方向旋转,以右后肢为支撑点,首尾相接,身体弯曲成环状,转速比较恒定,同时多伴有竖毛,30min内的旋转次数超过210圈,说明模型成功。模型成功率达80%。
　　
　　 2.Westernblot
　　
　　 2.1Nurr1
　　
　　 各组在分子量为66kD处均检测到Nurr1阳性条带。注射62OHDA后,腹侧中脑Nurr1蛋白表达量如Fig.1所示。另外,Nurr1蛋白相对表达量有时相性变化:术后1d急剧下降,7d开始上升,14d接近正常水平,28d明显升高(Fig.2)。方差分析和两两比较结果表明,除14d组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组间的表达量差异均有显著性意义(P<0.05)。
　　
　　 2.2TH
　　
　　 各组在分子量为62kD处检测到TH阳性条带(Fig.3)。术后不同时间点检测到腹侧中脑TH蛋白表达量如Fig.4所示,TH蛋白相对表达量术后1d变化不明显,7d明显下降,14d达到最低,28d开始恢复。方差分析和两两比较结果表明,除1d组与正常对照组相比,差异无统计学意义(Pœ0.05)外,其余各组间的表达量差异均有显著性意义(P›0.05)。
　　
　　 3.免疫组化染色
　　
　　 3.1Nurr1
　　
　　 在损伤侧黑质中,Nurr1阳性细胞数在1d组中明显减少,细胞胞体肿胀或空泡样变,突起变短,胞核固缩,细胞染色较浅。7d组中Nurr1阳性细胞数开始增加,染色加深。至14d细胞数和染色深度接近正常水平。28d阳性细胞数明显增加,染色较深(Fig.5)。方差分析和两两比较结果表明,Nurr1阳性细胞数和平均灰度值除14d组与正常对照组相比差异无统计学意义(Pœ0.05)外,其余各组间的差异均有统计学意义(P›0.05)。
　　
　　 3.2TH
　　
　　 损伤侧黑质区,1d组TH阳性细胞数及染色深浅和正常侧比较无明显改变。7d组可见TH阳性细胞数量减少,染色变浅。14d组TH阳性细胞大部分消失,残留细胞胞体肿胀,突起较短,染色较浅。28d组阳性细胞数比14d有所增加,染色较深(Fig.6)。方差分析和两两比较结果表明,TH阳性细胞数和平均灰度值除1d组与正常对照组相比差异无统计学意义(Pœ0.05)以外,其余各组间的差异均有统计学意义(P›0.05)。
　　
　　 各组黑质中Nurr1和TH阳性细胞数及平均灰度值统计结果见表1。
　　
　　 讨论
　　
　　 帕金森病是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,其基本病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元因各种原因而逐渐变性坏死,数量减少,致使纹状体内多巴胺神经递质匮乏而发病,目前临床上尚无满意的治疗方法。近年来神经干细胞(NeuralStemCells,NSCs)的研究为PD的治疗打开了一个全新的研究领域。应用NSCs进行神经修复治疗PD原则上有两个策略:一是通过细胞移植,将体外培养、扩增的外源性NSCs定向分化为多巴胺神经元后移植到纹状体中以期补充多巴胺神经递质而达到神经修复的目的;二是通过外源性刺激黑质2纹状体系统中存在的内源性NSCs增殖和向多巴胺神经元分化,从而达到自我修复的目的。目前国内外的一些学者在这方面已进行了许多尝试,然而研究的结果并不理想,主要问题是NSCs定向分化为特异性的多巴胺神经元难度较大[4]。NSCs分化为何种类型的神经细胞,不仅受到包括细胞因子在内的微环境的影响[5],更取决于内在的基因调控[6]。